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消栓口服液化學(xué)成分的變化論文
摘要：目的：檢測(cè)原工藝、發(fā)酵離心工藝、發(fā)酵醇沉工藝制備的消栓口服液中主要成分的含量變化。方法：采用HPLC法，以色譜峰面積為指標(biāo)，比較不同制備工藝消栓口服液中黃芪甲苷、芍藥苷、阿魏酸的含量變化。結(jié)果：發(fā)酵后黃芪甲苷的含量比原工藝組增加，而芍藥苷和阿魏酸的含量減少。結(jié)論：不同工藝制備的消栓口服液主要化學(xué)成分的含量有所不同，微生物發(fā)酵技術(shù)可以為中藥的開發(fā)利用提供新的思路。
關(guān)鍵詞：消栓口服液；發(fā)酵；含量測(cè)定
消栓口服液為臨床常用中藥，它是在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上研制的新劑型，具有補(bǔ)氣活血、通絡(luò)化瘀等功效。主治氣虛血瘀引起的后遺癥之半身不遂，口眼歪斜，言語不清，口角流涎，小便頻數(shù)，下肢痿廢，苔白脈緩以及脈絡(luò)阻滯之疑難雜癥[1]。消栓口服液是由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍、桃仁、紅花7味藥組成。方中重用黃芪補(bǔ)氣，與活血化瘀藥配伍，具有益氣活血的功效，用以治療氣虛血瘀型中風(fēng)[2]，具有良好的臨床效果[3]。發(fā)酵是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法之一[4]，發(fā)酵中藥借助微生物的作用，改變了中藥原有藥性，其主要特點(diǎn)就是發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化[5]。因此將微生物發(fā)酵技術(shù)引入中藥，也就是將藥材與輔料拌和，在一定溫度和濕度下，通過微生物發(fā)酵可以達(dá)到提高藥效、節(jié)約資源、降低毒副作用等目的[6]。目前，中草藥發(fā)酵的研究已從單味藥涉及到復(fù)方研究，并取得了顯著成果[7]。本文對(duì)不同工藝制備的消栓口服液中3種主要成分進(jìn)行含量測(cè)定，為消栓口服液的臨床用藥以及發(fā)酵中藥的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。
1儀器與試藥
1.1儀器
Agilent1200series高效液相色譜儀，AlltechSD2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國安捷倫）等。
1.2試藥與試劑
黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-200613）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-200526）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-200611），均購于中國藥品生物制品鑒定所；消栓口服液、發(fā)酵離心工藝消栓口服液、發(fā)酵醇沉工藝消栓口服液，均由濟(jì)南三株集團(tuán)醫(yī)藥生物研究所提供；甲醇、乙腈為色譜純；磷酸、醋酸等試劑均為國產(chǎn)分析純；哇哈哈純凈水等。
2含量測(cè)定的方法與結(jié)果
2.1樣品溶液的制備
2.1.1消栓口服液原工藝樣品的制備分別精密稱取黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花7味藥，加水煎煮2次，第1次1.5h，第2次為1h，合并煎液。濾過，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.18~1.22（50℃），加乙醇使含醇量為75%，靜置，取上清液，回收乙醇，濃縮藥液至120mL[8]，加蔗糖54g，加熱溶解，放冷，濾過，加苯甲酸鈉0.9g，加水稀釋至300mL，混勻，灌封，滅菌，即得[9]。2.1.2消栓口服液發(fā)酵后離心樣品的制備分別精密稱取上述7味藥，同法煎煮，合并煎液。濾過，濾液減壓濃縮至合適體積，配料，調(diào)pH，滅菌，接種噬酸乳桿菌、植物乳桿菌、短雙歧桿菌，37℃培養(yǎng)24h，穩(wěn)定化處理，離心，定容至750mL，分裝，滅菌，即得。2.1.3消栓口服液發(fā)酵后醇沉樣品的制備分別精密稱取上述7味藥，同法煎煮，合并煎液。濾過，濾液減壓濃縮至合適體積，配料，調(diào)pH，滅菌，接種噬酸乳桿菌、植物乳桿菌、短雙歧桿菌，37℃培養(yǎng)24h，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.18~1.22（50℃），加乙醇使含醇量為75%，靜置，取上清液，回收乙醇，濃縮藥液至適量，加蔗糖0.09g，溶解，放冷，濾過，加苯甲酸鈉0.9g，加水稀釋至300mL，混勻，分裝，滅菌，即得。
2.2對(duì)照品溶液的制備
2.2.1黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備取五氧化二磷減壓干燥24h的黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定。加甲醇制成每1mL含0.6260mg的對(duì)照品溶液[10]。2.2.2芍藥苷對(duì)照品溶液的制備取五氧化二磷減壓干燥36h的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含芍藥苷0.232mg的對(duì)照品溶液。2.2.3阿魏酸對(duì)照品溶液的制備取五氧化二磷減壓干燥24h的阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL溶液含阿魏酸0.108mg的對(duì)照品溶液。
2.3供試品溶液的制備
2.3.1黃芪甲苷供試品溶液的制備精密量取3種工藝消栓口服液各20mL，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次20mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次30mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為測(cè)定黃芪甲苷的供試品[11]。2.3.2芍藥苷供試品溶液的配置精密量取3種工藝消栓口服液各2mL，蒸干，加甲醇定容至25mL，超聲30min，放至常溫，補(bǔ)足損失甲醇，取續(xù)濾液，0.45μm濾膜濾過，作為測(cè)定芍藥苷的供試品[12]。2.3.3阿魏酸供試品溶液的配置精密量取3種工藝消栓口服液各25mL，加甲醇75mL，超聲20min，蒸干，用甲醇溶解，定容到10mL，過0.45μm濾膜，作為測(cè)定阿魏酸的供試品[13]。
2.4黃芪甲苷的含量測(cè)定
2.4.1色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-水（32∶68）為流動(dòng)相，流速：1mLmin-1，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度105℃，氣體流量3.0Lmin-1，柱溫25℃[14]。2.4.2線性關(guān)系考察精密量取黃芪甲苷對(duì)照品溶液，分別將5、10、15、20、25μL注入液相色譜儀中，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積積分值。以黃芪甲苷的峰面積對(duì)數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為Y=1.4303X+2.1451，R=0.9992，結(jié)果表明，黃芪甲苷在3.13~15.65μg進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)與峰面積的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。2.4.3方法學(xué)考察（1）精密度試驗(yàn)：吸取上述對(duì)照品溶液適量，按照上述色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芪甲苷峰面積，經(jīng)計(jì)算其RSD=1.63%（n=6），表明精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取消栓口服液的樣品供試液，按照上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24h測(cè)定，結(jié)果黃芪甲苷RSD=1.53%（n=6）。表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批原工藝消栓口服液，按上述方法平行制備6份并測(cè)定黃芪甲苷含量，結(jié)果平均含量為0.1844mgmL-1，RSD=1.75%。（4）加樣回收試驗(yàn)：取已測(cè)知黃芪甲苷含量（0.1844mgmL-1）的消栓口服液8mL，分別加黃芪甲苷對(duì)照品2.4mL（相當(dāng)于黃芪甲苷1.5024mg），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，分別精密吸取對(duì)照品溶液5、10μL，供試品溶液10μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定黃芪甲苷峰面積積分值，計(jì)算黃芪甲苷平均回收率。結(jié)果顯示，黃芪甲苷的平均加樣回收率為99.27%，RSD為1.46%。2.4.4含量測(cè)定分別取不同工藝消栓口服液各3批，按上述方法制備供試液并測(cè)定，每批連續(xù)進(jìn)樣3次，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中黃芪甲苷含量。2.4.5高效液相色譜圖見圖1~圖2。
2.5芍藥苷的含量測(cè)定
2.5.1色譜條件色譜柱：依利特HypersilODS2（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（20∶80），流速：1.0mLmin-1，柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：芍藥苷230nm，進(jìn)樣量：20μL[15]。2.5.2線性關(guān)系的考察取芍藥苷對(duì)照品溶液（0.2320mgmL-1），分別用甲醇配成0.2320、0.1160、0.0773、0.0464、0.0258mgmL-1的系列對(duì)照品溶液，取20μL注入液相色譜，用上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以芍藥苷對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，Y=28329X-11.7483，R=0.9994，表明芍藥苷在4.64~0.5165μg線性范圍內(nèi)峰面積與濃度的量呈良好線性關(guān)系。2.5.3方法學(xué)考察（1）精密度試驗(yàn)：取濃度為0.232mgmL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為1.35%，表明精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、16、24h進(jìn)樣測(cè)定，RSD=1.42%（n=6），表明在24h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份，按照上述方法測(cè)定，RSD=1.60%，表明重復(fù)性較好。（4）加樣回收試驗(yàn)：取原工藝消栓口服液2mL，加芍藥苷對(duì)照品11.25mL（相當(dāng)于芍藥苷2.61mg），按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品并測(cè)定，計(jì)算芍藥苷平均回收率。結(jié)果，芍藥苷的平均加樣回收率為99.65%，RSD為1.81%。2.5.4含量測(cè)定取不同工藝消栓口服液各3批，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品并測(cè)定，分別精密吸取20μL，每批連續(xù)進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中芍藥苷含2.5.5高效液相色譜圖
2.6阿魏酸的含量測(cè)定
2.6.1色譜條件色譜柱：依利特HypersilODSC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%醋酸水溶液；流速：1.0mLmin-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：阿魏酸320nm；進(jìn)樣量：20μL[16]。2.6.2線性關(guān)系的考察取阿魏酸對(duì)照品溶液（0.108mgmL-1），分別用甲醇配成0.036、0.0154、0.0098、0.0072、0.0057mgmL-1的系列對(duì)照品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：Y=94920X-81.2，R=0.9995。結(jié)果表明阿魏酸在0.114~0.72μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。2.6.3方法學(xué)考察（1）精密度試驗(yàn)：取濃度為0.108mgmL-1的阿魏酸對(duì)照品溶液，每次進(jìn)樣量20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積積分值，經(jīng)計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD的值為1.17%。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取原工藝消栓服液適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，每次進(jìn)樣量20μL，測(cè)定阿魏酸峰面積積分值，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.22%（n=6）。結(jié)果表明，供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批原工藝消栓口服液，按照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份，注入液相色譜儀，每次進(jìn)樣20μL，測(cè)定阿魏酸峰面積積分值。阿魏酸的平均含量為0.0112mgmL-1，RSD為1.30%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。（4）加樣回收試驗(yàn)：取原工藝消栓口服液10mL，加阿魏酸對(duì)照品1mL（相當(dāng)于阿魏酸0.108mg），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品并測(cè)定，計(jì)算回收率，平均回收率為99.23%，RSD為1.57。2.6.4含量測(cè)定取3批原工藝消栓口服液，按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品并測(cè)定，計(jì)算樣品中阿魏酸含量。2.6.5高效液相色譜圖見圖5~圖6。2.7結(jié)果從表1可以看出，黃芪甲苷的含量發(fā)酵前后比較是原工藝組最低，發(fā)酵離心組和發(fā)酵醇沉組都有些增高，而芍藥苷和阿魏酸正好相反，由于在消栓口服液中主要有效成分是黃芪甲苷，所以說可以進(jìn)行適量發(fā)酵。
3討論
本文對(duì)不同制備工藝的消栓口服液中的黃芪甲苷、芍藥苷、阿魏酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。含量測(cè)定方法參考有關(guān)權(quán)威文獻(xiàn)，采用高效液相色譜法，通過對(duì)流動(dòng)相的選擇、檢測(cè)波長(zhǎng)的確定、線性范圍、精密度、回收率等研究確定了最佳的檢測(cè)條件。結(jié)果顯示黃芪甲苷經(jīng)發(fā)酵后含量稍高于原工藝組，說明發(fā)酵后可能有些成分轉(zhuǎn)換為黃芪甲苷[17]，相反芍藥苷和阿魏酸經(jīng)發(fā)酵后的含量低于原工藝組，可能芍藥苷和阿魏酸經(jīng)過發(fā)酵后會(huì)分解或轉(zhuǎn)換[18]，因此黃芪甲苷、芍藥苷和阿魏酸等主要成分的含量變化有待進(jìn)一步研究。本文將發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的制備工藝，提高了中藥復(fù)方制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，從而保證了藥物的臨床療效[19]。該研究也為中藥開發(fā)研究提供了新的思路，具有很好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，為今后發(fā)酵中藥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)并奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[20]。
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