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酶促反應(yīng)對化學平衡的影響分析論文
酶的結(jié)構(gòu)和功能是生物化學的核心問題之一。對于酶催化的化學反應(yīng)，人們的一般認識是酶通過與底物的相互作用改變反應(yīng)途徑和活化能同等程度地催化正向與逆向反應(yīng)，不能改變化學平衡的方向和程度[1，2].然而，由于酶結(jié)構(gòu)和功能的多樣性與復雜性，酶促反應(yīng)的化學平衡問題也是復雜的[3，4].現(xiàn)代生物化學研究表明，酶可以通過自身與小分子的結(jié)合能改變在酶分子內(nèi)部的化學平衡，可以通過反應(yīng)耦合改變外部化學平衡，可以通過動力學控制得到熱力學上不利的產(chǎn)物。
因此，“酶促反應(yīng)不能改變化學平衡的方向和程度”的說法失之過簡，在生物化學教學中應(yīng)適當擴充。同時，認識酶促反應(yīng)中的化學平衡細節(jié)，有助于深入理解酶催化的本質(zhì)，并指導藥物化學設(shè)計或構(gòu)建人工催化體系[5，6].本文結(jié)合生物化學和物理有機化學理論，通過若干實例對酶促反應(yīng)對化學平衡的影響進行分析，以期對教學和研究提供新的思考。
1 酶促反應(yīng)的內(nèi)部化學平衡
一個典型的酶促反應(yīng)經(jīng)歷了以下步驟：酶分子E與底物S結(jié)合為復合物E?S；復合物E?S在酶催化下經(jīng)過過渡態(tài)[TScat]≠生成復合物EP；復合物ES解離為酶分子E和產(chǎn)物P.ΔG是S生成P的化學反應(yīng)在沒有酶催化條件下的化學反應(yīng)Gibbs自由能變，對應(yīng)于外部平衡常數(shù)K；ΔGint是酶分子內(nèi)部S生成P的化學反應(yīng)Gibbs自由能變，對應(yīng)于內(nèi)部平衡常數(shù)Kint；結(jié)合和解離步驟的Gibbs自由能變分別記為ΔGS和ΔGP；無酶參與時的過渡態(tài)[TS]≠與酶結(jié)合地過渡態(tài)[TScat]≠間的Gibbs自由能差記為ΔGTS.無酶參與的反應(yīng)活化能記為Ea，酶促反應(yīng)決速步的活化能記為Eacat，結(jié)合和解離步驟的活化能分別記為EaS和EaP.上述各能量之間的關(guān)系如圖1所示。
根據(jù)誘導契合假說[7]，酶促反應(yīng)的基本原理是通過酶與反應(yīng)決速步的過渡態(tài)[TS]≠的結(jié)合將其穩(wěn)定化為能量更低的[TScat]≠，從而達到降低活化能、提高反應(yīng)速率的目的。但由于底物、過渡態(tài)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的相似性，酶在與過渡態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)合的同時勢必也要不同程度地結(jié)合底物和產(chǎn)物，這使得酶內(nèi)部底物和產(chǎn)物的能量狀態(tài)與游離底物和產(chǎn)物的能量狀態(tài)不同，造成內(nèi)部化學平衡不同于外部化學平衡。根據(jù)圖1，ΔGint=ΔG-ΔGS-ΔGP，這說明內(nèi)部化學平衡取決于酶與底物和產(chǎn)物復合物的相對穩(wěn)定性。這種相對穩(wěn)定性會影響酶促反應(yīng)的速率。根據(jù)圖1，Eacat=Ea+ΔGTS-ΔGS，如果（ΔGTS-ΔGS）大于0，即酶對底物的穩(wěn)定化程度超過對過渡態(tài)的穩(wěn)定化程度，就會造成活化能的增大，從而不利于催化反應(yīng)。如果ΔGP過大，即酶對產(chǎn)物的穩(wěn)定化作用過強，就會造成EaP過大，同樣不利于催化反應(yīng)。因此，酶對底物和產(chǎn)物的穩(wěn)定化程度應(yīng)當維持在合理的水平上。Burbaum等[8]
從理論上證明，為保證酶催化的效率最大，內(nèi)部化學平衡常數(shù)總是趨近于1，ΔGint趨近于0.通過酶與底物、過渡態(tài)和產(chǎn)物的結(jié)合穩(wěn)定化作用，酶促反應(yīng)的內(nèi)部化學平衡一般與外部化學平衡不同，從而使得酶可以打破熱力學限制構(gòu)建內(nèi)部反應(yīng)途徑[9]，這是酶促反應(yīng)改變化學平衡的基礎(chǔ)。通過多級耦合內(nèi)部化學反應(yīng)，酶可以利用外部化學平衡有利的反應(yīng)貢獻的自由能使得外部化學平衡不利的反應(yīng)得以發(fā)生。
2 耦合酶促反應(yīng)的化學平衡
酶可以耦合不同的反應(yīng)，借此改變平衡方向。要滿足這一條件，有兩種不同的途徑：移走產(chǎn)物或者活化反應(yīng)物。在移走產(chǎn)物的耦合酶促反應(yīng)中，酶同時催化兩個反應(yīng)，在第一個反應(yīng)達到內(nèi)平衡達到后、E?P釋放前就進行第二步反應(yīng)�？傮w效果是避免了S與P的直接平衡，而是代之以E?P與E?S的平衡。如果后一步反應(yīng)的正向進行的趨勢很大，就使得第一步反應(yīng)的平衡發(fā)生移動。以蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase）[10]
為例（圖2），熱力學上蘋果酸氧化為草酰乙酸是不利的，但下一步耦合的草酰乙酸與乙酰-CoA的縮合反應(yīng)、得到的檸檬酸CoA硫酯水解失去CoA-SH的偶聯(lián)反應(yīng)都是熱力學上十分有利的反應(yīng)。因此，蘋果酸脫氫酶以NAD+為輔因子催化蘋果酸氧化為草酰乙酸，并與后續(xù)的乙酰CoA縮合、水解硫酯步驟偶聯(lián)，使得該高度不利的氧化反應(yīng)得以正向進行。
活化反應(yīng)物的耦合酶促反應(yīng)則相當于首先將E?P轉(zhuǎn)化為E?P'，進而以新的E?P‘與E?S的平衡取代了S與P的直接平衡。這兩步反應(yīng)同樣可以在同一個酶的活性位點中進行，這在自然界也廣泛存在[11，12]，與化學上的偶聯(lián)反應(yīng)很相似。例如羧基直接與氨基作用形成酰胺是熱力學熵不利的。但谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）[13]
可以使用ATP與底物谷氨酸的γ-羧基作用，先形成磷酸活化的羧基，進而被氨分子進攻離去磷酸基團，實現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)形成谷氨酰胺（圖3）。這兩個反應(yīng)的凈作用是羧酸轉(zhuǎn)化為酰胺，并伴隨一分子的ATP水解，利用高能的ATP水解反應(yīng)來推動羧基的酰胺化反應(yīng)�？梢钥闯�，磷酸活化羧基例子中將羧基與氨基形成酰胺的平衡轉(zhuǎn)化為羧基磷酸與氨基形成酰胺的平衡。
3 酶通過動力學控制改變化學平衡
除了前面提到的熱力學手段，酶還可以通過動力學手段影響反應(yīng)平衡，使得平行反應(yīng)中的一側(cè)在動力學上加速，另一側(cè)受阻，從而在有限的時間內(nèi)得到違背平衡產(chǎn)物的動力學控制結(jié)果。這種控制是通過酶與平行反應(yīng)不同過渡態(tài)的選擇性結(jié)合實現(xiàn)的，即特異性地結(jié)合過渡態(tài)降低某一個方向反應(yīng)的活化能壘，而難以形成另外一個方向的酶-過渡態(tài)復合體，即所謂“定位效應(yīng)”.以萜類的合成為例，在重要天然產(chǎn)物冰片（Borneol）的生物合成過程中[14，15]，環(huán)化產(chǎn)物發(fā)生碳正離子對雙鍵的親電加成。在經(jīng)典有機化學中，鹵素對雙鍵的加成遵循馬氏規(guī)則，即為了得到穩(wěn)定的碳正離子E2.但是，酶卻利用其活性位點的“定位效應(yīng)”決定反應(yīng)向反馬氏規(guī)則E1方向進行。當然，這并不是說酶只能按照反馬氏規(guī)則進行加成，對于同樣的底物，另一種酶則可以實現(xiàn)，并脫去質(zhì)子得到另一產(chǎn)物蒎烯（Pinene）（圖4）。
酶與底物結(jié)合后形成的特殊空間構(gòu)象決定了反應(yīng)的方向。在重要的單萜Thujone（圖5中化合物4）的生物合成中涉及的機理[16，17]的一部分如圖5，由三級碳正離子2轉(zhuǎn)化為二級碳正離子3，并進一步水合最終得到酮，這與三級碳正離子更穩(wěn)定的熱力學規(guī)則是相違背的。但在這里，酶通過空間效應(yīng)誘導底物親核試劑的進攻方向，導致得到的二級碳正離子可以立即轉(zhuǎn)化且對應(yīng)產(chǎn)物能量更低，相當于通過下一步快速反應(yīng)的耦合，利用動力學效應(yīng)左右反應(yīng)的進行[18，19].
此外，酶從動力學上對反應(yīng)的調(diào)控還受到環(huán)境因素的影響。例如，反應(yīng)介質(zhì)的改變可以導致酶促反應(yīng)方向的改變。在含有微量水分的有機溶劑中酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，當其失水造成的動力學剛性和得水造成的熱力學不穩(wěn)定性達到最適條件時，可使酶表現(xiàn)出最高的活性[20].再如，活性位點的“定位效應(yīng)”受到其中一些關(guān)鍵性作用基團的影響。環(huán)境的pH值可能通過影響這些關(guān)鍵性作用基團的電荷狀態(tài)而極大影響反應(yīng)平衡。對活性位點的篩選或理性設(shè)計可以影響甚至改變反應(yīng)平衡，乃至改變其底物的識別性能[21].
4 結(jié)論
酶促反應(yīng)中的化學平衡問題是復雜的，酶通過自身與底物、過渡態(tài)、產(chǎn)物的特異性結(jié)合作用改變化學反應(yīng)中的能量關(guān)系，并達到通過內(nèi)部化學平衡或動力學控制方法得到非熱力學產(chǎn)物的結(jié)果，從而在形式上改變了化學平衡。這一點長期在各類教科書上被絕對化地描述為“酶不能改變反應(yīng)平衡”，這樣的認識對于教學與科研是不利的。
參 考 文 獻
[1] 王鏡巖， 朱圣庚， 徐長法。 生物化學（上冊）。 3版。 北京：高等教育出版社， 2002， 320
[2] 傅獻彩， 沈文霞， 姚天揚。 物理化學（下冊）。 5版。 北京：高等教育出版社， 2006， 292-296
[3] Fersht A. Structure and mechanism in protein science: aguide to enzyme catalysis and protein folding. New York:W. H. Freeman and company， 1999， 103-131
[4] Purich DL. Enzyme kinetics: catalysis & control. Elsevier，2010， 15-25
[5] 馬軍安， 黃潤秋。 酶催化過渡態(tài)理論在藥物分子設(shè)計中的應(yīng)用。 合成化學， 2000， 8: 479-485
[6] 王志鵬， 馮天師， 崔麗嘉， 等。 過渡態(tài)理論于磺胺藥物抑菌機理芻議。 中國科學： 生命科學， 2013， 9: 009
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