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極低頻電磁場(chǎng)照射后細(xì)胞間的通訊
摘要：低頻脈沖電磁場(chǎng)能夠影響成骨細(xì)胞的增殖, 但其機(jī)理還有待研究。 使用15 Hz, 4 mT 矩形電磁場(chǎng)照射新生鼠顱骨細(xì)胞, MTT 方法測(cè)量細(xì)胞的增殖率, 通過(guò)電磁屏蔽與光隔離方法研究細(xì)胞間的通訊。 結(jié)果表明, 電磁場(chǎng)照射后的細(xì)胞能夠輻射一種光信號(hào), 受電磁場(chǎng)照射的成骨細(xì)胞可以通過(guò)這種光輻射的通訊方式促進(jìn)未受電磁場(chǎng)照射的正常成骨細(xì)胞的增殖(P < 0。05)。
關(guān)鍵詞：電磁場(chǎng)、成骨細(xì)胞、增殖、通訊
低頻脈沖電磁場(chǎng)(PEMF)對(duì)骨不連病人的治療及骨愈合等疾病有顯著的促進(jìn)作用[1,2], 特別是由于近年來(lái)環(huán)境中低頻電磁場(chǎng)污染的增加, 低頻電磁場(chǎng)生物效應(yīng)已經(jīng)成為了社會(huì)廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題, 并引發(fā)了電磁場(chǎng)生物效應(yīng)機(jī)理研究的熱潮[3~5]。 從電磁場(chǎng)作用后細(xì)胞的響應(yīng)來(lái)看, 電磁場(chǎng)可以通過(guò)細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)鈣離子途徑直接影響成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化[6~8], 電磁場(chǎng)也可能通過(guò)對(duì)DNA的直接作用影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄功能[9]。 從電磁場(chǎng)特征來(lái)看, 目前能夠肯定的是電磁場(chǎng)的生物效應(yīng)存在強(qiáng)度與頻率窗口[10]。 電磁場(chǎng)生物效應(yīng)機(jī)理的研究已經(jīng)有很多年的歷史, 但仍然沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展, 還存在很多問(wèn)題, 表明電磁場(chǎng)生物效應(yīng)的復(fù)雜性, 也提示我們應(yīng)當(dāng)更深入地研究其機(jī)理效應(yīng)。 本文研究了電磁場(chǎng)刺激后細(xì)胞間的通訊問(wèn)題。
1 材料與方法
(ⅰ) 試劑。 本研究使用試劑包括DMEM 培養(yǎng)液(GIBCO 公司), 新生牛血清(杭州四季青生物制品公司), MTT(Sigma 公司)。
(ⅱ) 電磁場(chǎng)的產(chǎn)生。 電磁場(chǎng)發(fā)生儀自行研制,能夠在多層線圈繞制的螺線管內(nèi)產(chǎn)生頻率、強(qiáng)度可調(diào)的矩形、正弦、三角等多種波形的低頻電磁波。 為了保證螺線管中電磁場(chǎng)比較均勻, 螺線管的直徑與長(zhǎng)度分別設(shè)計(jì)為5 和25 cm, 螺線管中磁感應(yīng)強(qiáng)度按理論公式計(jì)算: B = μ0nI ( μ0 為真空磁導(dǎo)率, 其值為4π × 10−7H/m, n 為線圈單位長(zhǎng)度的匝數(shù), I 為通過(guò)線圈的電流強(qiáng)度), 電流使用示波器及A622 探頭測(cè)量獲得(Tektronix,USA)。 本研究所用矩形波電磁場(chǎng)參數(shù)為: 頻率15 Hz,峰值強(qiáng)度4 mT, 占空比15%。
(ⅲ) 細(xì)胞培養(yǎng)。 無(wú)菌條件下, 取出生24 h 內(nèi)的SD 大鼠顱蓋骨(購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),胰蛋白酶(1。25 g/L)消化20 min; 用10%血清的DMEM 培養(yǎng)基沖洗兩遍, 接種于培養(yǎng)瓶中, 待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶壁時(shí)傳代培養(yǎng)。 第3 代細(xì)胞用含10%血清的DMEM 培養(yǎng)基稀釋成5×104/mL 細(xì)胞的懸液, 以每孔200 μL 接種于由96 孔培養(yǎng)板加工而成的小孔中繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 而后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組與電磁照射組, 實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)照組與電磁照射組分別置于兩個(gè)完全一樣的螺線管中, 對(duì)照組不加電磁場(chǎng)放置30min, 電磁照射組加磁場(chǎng)照射30 min, 磁場(chǎng)方向與培養(yǎng)皿底部垂直, 而后繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 照射兩次后用MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖率。 為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2 次。
(ⅳ) 成骨細(xì)胞增殖檢測(cè)。 96 孔培養(yǎng)板的每孔內(nèi)加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL, 37℃孵育4 h, 吸盡培養(yǎng)基并于每孔加入二甲基亞砜150 μL, 振蕩10min, 用酶標(biāo)儀(TECAN, 澳大利亞)測(cè)量570 nm 波長(zhǎng)時(shí)的光密度(A)值。
(ⅴ) 數(shù)據(jù)處理。 統(tǒng)計(jì)分析使用了Sigma Plot 軟件中的t 檢驗(yàn), 數(shù)據(jù)表示為X ± SD。
2 結(jié)果
電磁屏蔽實(shí)驗(yàn)分為5 組。 其中有3 個(gè)對(duì)照組, 代分別稱(chēng)為對(duì)照組、電磁場(chǎng)屏蔽對(duì)照組(ESC)、無(wú)電磁場(chǎng)屏蔽對(duì)照組(ENSC)。 另2 個(gè)為電磁場(chǎng)照射組, 分別為電磁屏蔽的電磁場(chǎng)照射組(ESS)和無(wú)電磁屏蔽的電磁場(chǎng)照射組(ESNS)。 對(duì)照組與電磁照射組的實(shí)驗(yàn)方法同上, 但電磁照射結(jié)束后, ESC 組與ESS 組分別用200 目銅網(wǎng)制成的長(zhǎng)方體箱包裹, 貼在一起共同放入培養(yǎng)箱培養(yǎng), ESNS 組與ENSC 組直接貼在一起放入200 目銅網(wǎng)制作的長(zhǎng)方體箱中共同培養(yǎng), 對(duì)照組置于銅網(wǎng)中單獨(dú)培養(yǎng), 結(jié)果見(jiàn)圖1。 可以看出, 其他4 組與對(duì)照組差異顯著(P < 0。05, n = 8), 但4 組之間無(wú)顯著差異(P > 0。05, n = 8)。光隔離實(shí)驗(yàn)也分為5 組。 其中3 個(gè)對(duì)照組分別為對(duì)照組、光未隔離對(duì)照組(LNIC)、光隔離對(duì)照組(LIC),2 個(gè)電磁照射組分別為光隔離的電磁場(chǎng)照射組(ELI)與光未隔離的電磁場(chǎng)照射組(ELNI)。 電磁照射的實(shí)驗(yàn)方法同上, 但電磁照射結(jié)束后, LIC 與ELI 組用黑色玻璃片隔離后貼在一起共同放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),LNIC 組與ELNI 組用透明玻璃片隔離后貼在一起放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng), 對(duì)照組單獨(dú)培養(yǎng), 結(jié)果見(jiàn)圖2。
可以看出, ELI, ELNI, LNIC 組與對(duì)照組差異顯著(P <0。05, n = 8), LIC 組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P > 0。05, n =8), 但與ELI 組顯著差異(P < 0。05, n = 8)。
3 討論
電磁場(chǎng)生物效應(yīng)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn), 螺線管中交變磁場(chǎng)可以引起成骨細(xì)胞增殖[11], 4 mT, 15 Hz低頻矩形電磁場(chǎng)能夠使細(xì)胞增殖率顯著增加[12], 本研究結(jié)果表明, 不但磁場(chǎng)照射后的成骨細(xì)胞增殖率可以顯著增加, 而且與電磁場(chǎng)照射后的細(xì)胞相互接近共同培養(yǎng)的對(duì)照組細(xì)胞的增殖率也顯著增高(圖1和2), 提示受磁場(chǎng)照射與未受磁場(chǎng)照射的細(xì)胞間存在影響細(xì)胞增殖的信號(hào)通訊。 細(xì)胞分裂過(guò)程中能夠產(chǎn)生一種特殊的物理信號(hào), 通過(guò)這種物理信號(hào)能夠影響其他細(xì)胞的分裂[13]。 從物理學(xué)的角度分析, 細(xì)胞間的影響可能表現(xiàn)為電磁波通訊, 為此我們使用電磁屏蔽與光隔離的方法進(jìn)行了研究。 圖1 表明, 電磁屏蔽沒(méi)有影響細(xì)胞間的這種通訊, 因?yàn)闊o(wú)論是加了電磁屏蔽的細(xì)胞, 還是沒(méi)有被屏蔽的細(xì)胞, 只要將他們相互貼近一起培養(yǎng), 電磁照射組與對(duì)照組細(xì)胞的增殖率就沒(méi)有差異, 但卻都顯著高于對(duì)照組(P <0。05), 該結(jié)果提示, 細(xì)胞被磁照射后能夠產(chǎn)生使正常細(xì)胞增殖的信號(hào), 而且這種信號(hào)不能被銅網(wǎng)產(chǎn)生的電磁屏蔽阻斷。 圖2 說(shuō)明, 這種影響細(xì)胞增殖的通訊信號(hào)可能是一種光信號(hào), 因?yàn)檎＜?xì)胞與受電磁刺激的細(xì)胞間的通訊作用可以被黑色玻璃片阻斷(P <0。05), 但不受透明玻璃片影響(P < 0。05)。 總之, 本研究結(jié)果表明, 成骨細(xì)胞被電磁照射后可能輻射一種光信號(hào), 通過(guò)這種信號(hào)可以刺激其他未受電磁照射的細(xì)胞, 并使其增殖率增加。
成骨細(xì)胞的增殖與細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)的鈣離子密切相關(guān)[3,14], 光輻射可以影響細(xì)胞內(nèi)的鈣過(guò)程[15],這為本課題的后續(xù)深入研究提供了思路。
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