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原發(fā)性支氣管肺癌中PTEN基因的蛋白表達及意義論文
目的 研究抑癌基因PTEN在原發(fā)性肺癌中的蛋白表達及其臨床意義。方法 應用免疫組織化學SP法檢測56例手術(shù)切除的肺癌石蠟標本及3例正常肺組織中的PTEN基因的蛋白表達情況。結(jié)果 ①正常肺組織中PTEN蛋白表達的陽性率明顯高于肺癌患者，而在小細胞肺癌中的陽性表達低于非小細胞肺癌；②在56例肺癌患者中，隨著分化程度的降低，PTEN的蛋白陽性表達率也隨之下降；③Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者的PTEN蛋白陽性表達率高于Ⅲ、Ⅳ期患者；④在19例有轉(zhuǎn)移的肺癌患者中，PTEN表達陽性率明顯低于無轉(zhuǎn)移的患者。結(jié)論 PTEN基因的表達與肺癌的病理類型、組織的分化程度、臨床分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。ABSTRACT: Objective To study the protein expression level and clinicalsignificance of the tumor suppressor gene PTEN in primary lung cancer. Methods We detected the protein expression of PTEN gene in paraffin specimens of 56 cases of lung cancer and 3 specimens of normal lung tissues by SPimmunohistochemistry. Results ① The positive rate of PTEN protein expression was higher in normal lung tissues than in lung cancer specimens, while it was lower in SCLC than in NSCLC. ② The positive rate of expression of PTEN protein became lower as the differentiation level decreased in the 56 cases of lung cancer specimens. ③ The positive rate of expression of PTEN protein was higher in patients with lung cancer of stage Ⅰ and Ⅱ than that in stage Ⅲ and Ⅳ. ④ The positive rate of expression of PTEN protein was 26.32% in 19 cases of transfused specimens, which was obviously lower than that in non-transfused specimens. Conclusion The expression of PTEN gene is related to classification criteria of lung cancer, malignancy degree, clinical stage and lymph node transfusion.
KEY WORDS: lung cancer; phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10 gene(PTEN); immunohistochemistry
腫瘤的發(fā)生是多階段、多步驟和多基因改變的過程，腫瘤的惡性表型是多種因素相互作用導致正常細胞惡變的結(jié)果，而癌基因的激活和抑癌基因的失活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。對抑癌基因的研究不僅在探索腫瘤發(fā)生的分子生物學機制方面有重要意義，而且在腫瘤的預防、治療、誘導分化、凋亡、衰老等方面也有重大價值。PTEN基因(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10 gene)又稱MMAC1(mutated in multiple advanced cancers gene)或TEP1(TGF-regulated and epithelial phosphatase 1 gene)，是1997年由Steck等［1］3個研究小組分別發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的抑癌基因(簡稱PTEN)�，F(xiàn)已證實該基因的突變、失活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為探討原發(fā)性支氣管肺癌中PTEN基因的蛋白表達與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們用免疫組織化學方法對56例肺癌患者石蠟標本及3例正常肺組織標本進行了研究。
1 材料與方法
1.1 材料
所有標本均取自西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院病理科2001年至2004年間石蠟包埋標本，56例經(jīng)病理學檢查證實為原發(fā)性肺癌。其中男性39例，女性17例；年齡36-75歲，平均55歲。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療。根據(jù)WHO(1981)肺癌的分類標準進行組織學分類，根據(jù)腫瘤的分級標準(組織結(jié)構(gòu)、異型性等)進行病理分級。其中鱗癌23例、腺癌20例、小細胞肺癌13例；病理分級為分化良好的17例、中等分化24例、分化不良15例。TNM分期按UICC(1997)標準進行：Ⅰ期12例、Ⅱ期18例、Ⅲ期15例、Ⅳ期11例。肺門和(或)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移(簡稱轉(zhuǎn)移)：有轉(zhuǎn)移19例、無轉(zhuǎn)移37例。3例正常肺組織為對照，來自手術(shù)切除的癌旁正常肺組織(至少距離癌腫5 cm以上)。
1.2 方法
采用免疫組化SP法。鼠抗人PTEN單克隆抗體及SP試劑盒均購于北京中山生物公司。標本經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張，厚5 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色復查診斷。免疫組化檢測步驟：一抗稀釋濃度1∶50，常規(guī)脫蠟后微波爐抗原修復，4 ℃過夜，PBS洗；二抗37 ℃ 30 min，PBS洗；加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37 ℃ 30 min，PBS洗；DAB顯色，蘇木素復染。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。
1.3 結(jié)果判定
參照Fromowitz等的方法［2］。首先按染色強度評分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再按陽性細胞所占的百分比評分：0分為陰性，1分為陽性細胞≤10%，2分為11%-50%，3分為51%-75%，4分為＞75%。染色強度與陽性細胞百分比的分值乘積>3分為免疫組化反應陽性。
1.4 統(tǒng)計學分析
應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差(x±s)表示，計數(shù)資料組間的比較均采用卡方檢驗，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 PTEN蛋白在肺癌組織中的定位
陽性染色主要位于癌細胞質(zhì)(膜)，癌細胞核也有部分表達；陽性產(chǎn)物呈棕黃色彌漫分布(圖1)。
2.2 PTEN蛋白表達與肺癌一般臨床特征的關(guān)系
PTEN在56例肺癌患者中的表達陽性率為37.50%，其中PTEN表達陽性的患者平均年齡為(53.35±8.70)歲，表達陰性的患者平均年齡為(54.90±9.25)歲，兩者相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；39例男性患者中PTEN陽性表達率為41.03%，17例女患者中為29.14%，兩者相比亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
2.3 PTEN蛋白表達與肺癌病理類型的關(guān)系
56例肺癌患者PTEN蛋白表達的陽性率為50.00%，其中23例鱗癌中的陽性率為60.87%，20例腺癌中的陽性率為55.00%，兩者比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；13例小細胞癌中的陽性表達率為23.08%，其PTEN陽性率明顯低于前兩者，且具有顯著性差異(P<0.05)。說明PTEN在小細胞肺癌中的陽性表達低于非小細胞肺癌，提示PTEN的蛋白表達與肺癌的病理類型有關(guān)。
2.4 PTEN蛋白表達與肺癌分化程度的關(guān)系
在56例肺癌患者中，隨著分化程度的降低，PTEN的蛋白表達陽性率也隨之下降，分化良好者較中等分化者PTEN表達陽性率為高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而分化不良者與前兩者相比PTEN蛋白陽性表達率明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。表1 PTEN蛋白表達與肺癌分化程度的關(guān)系（略）
2.5 PTEN蛋白表達與肺癌臨床分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系
�、�、Ⅱ期患者的PTEN蛋白陽性表達率相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ期患者的PTEN蛋白表達陽性率明顯降低，與Ⅰ、Ⅱ期相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示隨著病變的進展，PTEN的表達率呈下降趨勢。在19例有轉(zhuǎn)移的患者中，PTEN表達陽性率為26.32%，明顯低于無轉(zhuǎn)移者，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。表2 PTEN的蛋白表達與肺癌臨床分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系（略）
3 討論
PTEN是一種多功能的磷酸酯酶，主要有以下功能［3］：①參與胚胎的正常發(fā)育［4］； ②通過G1期阻滯或誘導細胞凋亡機制，抑制細胞生長；③抑制端粒酶的活性；④抑制細胞的遷移、鋪展和局部黏附。許多研究顯示，PTEN基因的缺失、突變或表達產(chǎn)物的失活，影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展。Kohno等［5］檢測了40株肺癌細胞系，發(fā)現(xiàn)15株小細胞肺癌中6株發(fā)生了PTEN DNA純合性丟失，25株非小細胞肺癌中2株發(fā)生了PTEN DNA純合性丟失，2株有無活性突變和錯義突變，小細胞肺癌的PTEN失表達率似乎高于非小細胞肺癌，說明PTEN在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中作為一個抑癌基因發(fā)揮作用。且有研究顯示，PTEN蛋白表達水平的高低與患者的病理分級及預后有關(guān)，患者預后越差，惡性度越高，PTEN蛋白水平越低。提示PTEN可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤和轉(zhuǎn)移。
本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中PTEN基因的蛋白表達主要分布于癌細胞質(zhì)，核膜上也有著色，而且正常肺組織較肺癌組織著色明顯增強。這與Hager等［6］對腎細胞癌的相關(guān)研究相似。盡管不同年齡、性別患者的PTEN基因的蛋白表達不同，但差異甚微，提示PTEN基因的表達與患者的年齡、性別無關(guān)。實驗中，肺癌組織PTEN基因的蛋白表達陽性率為50%，正常肺組織PTEN基因的蛋白表達陽性率為93.27%，肺癌組織PTEN基因的蛋白表達顯著低于正常肺組織，認為原發(fā)性支氣管肺癌中PTEN基因的蛋白表達下調(diào)，提示PTEN基因的蛋白表達缺失在肺癌的發(fā)生中可能起重要作用。但Hosoya等［7］報道PTEN基因的突變率只有13.30%，遠遠低于本實驗檢測到的PTEN基因的蛋白表達缺失率(由陽性率計算)50%。其原因可能是：①影響PTEN基因的蛋白表達的因素很多，如PTEN基因的純和性丟失或突變、PTEN基因的雜合性丟失、PTEN基因啟動子的甲基化、非翻譯區(qū)的微小病變等均可導致該基因的低表達或不表達；②在PTEN基因復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾的水平也可發(fā)生PTEN基因的低表達或不表達。
目前的一些研究結(jié)果提示，PTEN基因的變異與肺癌的不同病理類型有關(guān)［8-9］。Zhang等［10］研究顯示，PTEN在小細胞肺癌中的缺失率達44%，高于非小細胞肺癌(24%)，提示PTEN的缺失在肺癌，尤其是小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。本研究顯示PTEN基因蛋白表達在非小細胞肺癌中的陽性率明顯高于小細胞肺癌中的表達陽性率(鱗癌60.87%、腺癌55.00%、小細胞癌23.08%)，說明PTEN基因的表達與腫瘤的組織類型密切相關(guān)，尤其在小細胞肺癌中可能發(fā)揮重要作用。
關(guān)于PTEN基因與肺癌病理分級，臨床分期的關(guān)系，國內(nèi)外報道不多。Sano等［11］研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因表達水平的高低與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的病理分級相關(guān)，PTEN基因表達水平越低，說明腫瘤的惡性程度越高，臨床分期越晚，預后也就越差。本實驗結(jié)果也顯示分化不良的肺癌PTEN基因的蛋白表達陽性率低于分化良好和中等分化者，且臨床分期越晚，PTEN基因的蛋白陽性表達率也越低，提示PTEN基因表達與腫瘤的惡性程度、臨床分期密切相關(guān)，表達水平越低，臨床分期越晚，腫瘤的惡性程度越高。
Salvesen等［12］報道子宮內(nèi)膜癌PTEN啟動子甲基化患者很容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本實驗也顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者PTEN基因的蛋白表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示PTEN基因的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表達陽性率越低，越容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這可能是因為PTEN基因低表達的肺癌患者失去了PTEN對FAK介導的細胞浸潤、轉(zhuǎn)移和生長的抑制作用，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
PTEN基因的蛋白在肺癌組織中的表達較正常肺組織中的表達有所降低，說明PTEN基因的低表達可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。該基因的表達與肺癌患者的年齡、性別無關(guān)，而與肺癌的病理類型、組織的分化程度、臨床分期、以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明PTEN基因可能作為判斷肺癌病情嚴重程度及預后的指標，也可作為基因治療的靶基因。這為今后肺癌的診斷及治療提供新的思路。
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