維A酸對大鼠胃癌前病變增殖細胞核抗原和端粒酶活性的影響論文

　　【摘要】  目的 觀察維A酸（RA）對大鼠胃癌前病變增殖細胞核抗原（PCNA，用增殖指數(shù) PI表示） 和端粒酶活性（用hTERT表示）的影響。方法 采用甲硝基亞硝基胍（MNNG）、0.03%雷尼替丁、56 ℃15%鹽水、0.85%脫氧膽酸鈉、40%乙醇、饑飽失常等多種因素制作大鼠胃癌前病變模型，免疫組化方法檢測正常組、自然恢復組、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg組大鼠胃黏膜組織中 PI 和 hTERT 蛋白表達情況。結(jié)果 正常組和RA 40 mg/kg組PI、hTERT 蛋白陽性率均較自然恢復組低，差異有顯著性（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 維A酸可能是通過抑制端粒酶及細胞增殖活性，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的作用。
　　
　　Abstract:Objective To observe the effect of retinoic acid（RA） on proliferating cell nuclear antigen (PCNA, represented with proliferating index, PI) and telomerase activity (represented with human telomerase reverse transcriptase，hTERT) in rats with  gastric  precancerous lesion． Methods  The model was established by MNNG together with other factors including 15% 56 ℃ brine，sodium deoxycholate， 40% alcohol stimulus， 0.03% ranitidine， undue hunger，and overeating． PCNA(converted to PI) and hTERT was detected by immunohistochemical method， in normal group， spontaneous recovery group，and RA（20 mg/kg and 40 mg/kg） group．Results  PI and hTERT of normal group and RA 40mg/kg groups were lower detected than spontaneous recovery group and was significantly different (P<0.01 or P<0.05)． Conclusion  RA  makes GPL reversed in rates by inhibiting  activity of telomerase and cell proliferating．
　　
　　Key words: retinoic  acid； precancerous lesions； proliferating cell nuclear antigen；telomerase
　　
　　利用某些化學物質(zhì)誘導腫瘤細胞分化為正常細胞或近似正常細胞，已成為抗腫瘤藥物研究的熱點，維A酸是腫瘤分化誘導劑的代表之一。維A酸對多種化學致癌過程和誘癌作用有抑制作用，具有逆轉(zhuǎn)胃癌前病變大鼠的腸化生和不典型增生作用，對急性早幼白血病M 型的療效，已被證實和公認［1，2］。為進一步探討其作用機理，本文觀察維A酸對大鼠胃癌前病變增殖細胞核抗原和端粒酶活性的影響，報告如下。
　　
　　1  材料
　　
　　1.1  實驗動物SPF級，雄性 Wistar大鼠，6周齡， 體質(zhì)量100～120 g,由湖北省實驗動物研究中心提供 ,生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2003-0005。
　　
　　1.2  主要藥品及試劑維A酸( RA) ，上海第六制藥廠；甲硝基亞硝基胍（MNNG）為 Fluka 公司產(chǎn)品；脫氧膽酸鈉 ，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；雷尼替丁， 杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司；無水乙醇 ，上海振新興化工一廠；氯化鈉 ，天津化學試劑三廠；即用型PCNA 單抗、即用型端粒酶催化活性亞單位（hTERT）多抗試劑盒、SPDAB 即用型顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)公司。
　　
　　1.3  主要儀器CUT 5062輪轉(zhuǎn)切片機，德國SLEE公司；BX 40系統(tǒng)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；HPIAS1000 型顯微攝像全自動圖像分析儀，同濟千屏影像工程公司。
　　
　　2  方法
　　
　　2.1  造模及給藥方法按綜合法復制模型 ［ 3］。大鼠50只，隨機抽取 11只作為正常對照組，其余 39只用于造模。正常對照組大鼠不做任何處理；造模大鼠每日自由飲用 100 μg/mL MNNG 液（新鮮配制，飲水瓶用油漆涂黑避光），上午用 56 ℃、 ρ=15%的氯化鈉液 10 mL/kg 灌胃。攝食為含ρ= 0.03%雷尼替丁的純鼠飼料，饑飽相間，進食2 d的當天下午，用 ρ=0.85%脫氧膽酸鈉溶液按10 mL/kg 灌胃；禁食1 d的當天下午，用 φ=40％乙醇10 mL/kg 灌胃，持續(xù)6個月(造模過程中死亡6只大鼠)。6個月末時，取正常和造模大鼠各1只殺檢，觀察組織病理學變化，確認模型是否成功。模型成功后，將造模存活的大鼠，隨機分為：自然恢復組12只、RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg組各10只。
　　
　　正常對照組和自然恢復組大鼠給蒸餾水10 mL/kg； RA 20 mg/kg和RA 40 mg/kg組大鼠分別給0.2% RA和 0.4% RA 10 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)3個月(自然恢復組大鼠死亡 4只)。末次給藥后，所有動物禁食1 d，放血處死，剖腹取胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗，肉眼觀察，平鋪于硬紙板上，于胃竇部剪取組織1塊，Φ=4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片 5 μｍ，免疫組織化學染色。
　　
　　2.2  檢測方法免疫組織化學用 SP法，按試劑說明書操作，DAB 顯色，PBS 代替一抗作陰性對照，已知陽性切片作陽性對照。免疫組化染色陽性信號為棕色，PCNA 陽性物質(zhì)定位于細胞核， hTERT 陽性物質(zhì)定位于細胞質(zhì)。采用顯微攝像計算機圖像分析系統(tǒng)，每張切片檢測5個視野（×400）。計算PCNA陽性細胞數(shù)以及腺上皮細胞總數(shù)（每例≥200 個），求出細胞增殖指數(shù)（PI）， PI=PCNA 陽性細胞數(shù)/腺上皮細胞總數(shù)×100%。hTERT：無陽性細胞或陽性細胞數(shù)<25%為（-），陽性細胞數(shù)25％～50%為（＋），陽性細胞數(shù) 50％～75%為（＋＋），陽性細胞數(shù)>75%為（＋＋＋）。
　　
　　2.3  統(tǒng)計學處理PI 值的比較，采用t檢驗； hTERT 蛋白表達陽性率的比較，采用χ2檢驗（校正χ2值計算），以P<0.05為差異有顯著性。
　　
　　3  結(jié)果
　　
　　3.1  維A酸對胃黏膜細胞增殖指數(shù)的影響　　正常大鼠胃黏膜增生帶細胞可見 PCNA 陽性細胞； 自然恢復組大鼠胃黏膜細胞增殖指數(shù)明顯高于正常對照組和維A酸各組， 差異有非常顯著性（P<0.01）；維A酸組高于正常對照組，提示維A酸有一定的抑制胃黏膜細胞增殖活性作用，見表 1。
　　
　　表1  維A酸對胃黏膜細胞增殖指數(shù)的影響（略）
　　
　　Tab.1  Effect of RA on PI of the gastric mucosa
　　
　　與自然恢復組比較： *P<0.01；與正常對照組比較： ▲P<0.01  ( t檢驗 )
　　
　　3.2  維A酸對胃黏膜細胞hTERT 蛋白表達陽性率的影響　　 正常大鼠胃黏膜沒有hTERT 蛋白表達。自然恢復組大鼠8例均呈陽性表達，陽性率達100％。維A酸20 mg/kg和40 mg/kg組 hTERT 蛋白陽性率分別為60%和40% ,較自然恢復組低，見表 2。
　　
　　表2  維A酸對胃黏膜細胞hTERT 蛋白表達陽性率的影響（略）
　　
　　Tab.2  Effect of RA  on  hTERT positive rate of the gastric mucosa
　　
　　與自然恢復組比較：*P<0.05;**P<0.01；與正常組比較：▲P<0.05(χ2檢驗)
　　
　　4  討論
　　
　　增殖細胞核抗原（PCNA）是目前被公認的能較好地判斷細胞增殖狀態(tài)的一項指標［ 4］。
　　
　　PCNA又稱周期數(shù)，是存在于細胞核內(nèi)的一種周期蛋白。研究表明，在胃癌前病變階段已存在PCNA的表達異常，推論胃黏膜發(fā)生癌變的機制之一，可能是某些致癌因素引起持續(xù)的胃黏膜細胞增殖過度。
　　
　　端粒酶活化是細胞保持持續(xù)分裂增殖的基礎，與細胞的異常增殖密切相關，是腫瘤發(fā)生學上的一個共同途徑，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用［5］。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，至少由3個亞單位組成，即端粒酶RNA、端粒酶相關蛋白Ⅰ和端粒酶催化活性亞單位（hTERT），但僅 hTERT 水平與細胞端粒酶活性呈正相關［6］。
　　
　　研究發(fā)現(xiàn)由胃黏膜正常細胞→胃癌前病變→胃癌的過程中，端粒酶逐漸被激活［7］，
　　
　　而且其陽性率、活性水平相應地逐漸增高；也有研究發(fā)現(xiàn)端粒酶陽性的胃癌或癌前病變細胞增殖活性（PCNA）明顯高于陰性者［8］，
　　
　　均說明端粒酶的激活在胃黏膜癌變形成、發(fā)展中扮演重要角色。
　　
　　本實驗模擬臨床發(fā)病原因，采用多因素建立胃癌前病變大鼠模型，側(cè)重維A酸對其逆轉(zhuǎn)作用機理研究。結(jié)果顯示：正常大鼠胃黏膜增殖帶可見PCNA 陽性細胞，但沒有hTERT 活性表達，自然恢復組大鼠 PI明顯高于正常組，hTERT蛋白陽性表達率 100%，表明在胃癌前病變階段，由于各種因子的刺激而導致了端粒酶被激活和細胞增殖活性增加，使部分細胞逃脫死亡危象，并出現(xiàn)永生化或惡性增殖。
　　
　　模型動物應用維A酸治療 3個月后，大鼠胃黏膜 PI和hTERT 蛋白的表達顯著降低，表明維A酸對其端粒酶活性和細胞增殖活性有一定的抑制作用。由此推論維A酸逆轉(zhuǎn)大鼠胃癌前病變的機制之一，可能與其抑制了大鼠胃癌前病變PCNA和端粒酶活性，從而抑制胃黏膜惡性增殖，增加細胞穩(wěn)定性，恢復細胞增殖和凋亡平衡有關。

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