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HPLC法測(cè)定益肝靈片中水飛薊賓的含量
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【摘要】 目的 建立測(cè)定益肝靈片中水飛薊賓含量的方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Dikma Diamonsid C18柱，甲醇?1%冰醋酸(體積比49∶51)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm，柱溫為30 ℃。結(jié)果 水飛薊賓的質(zhì)量濃度在20.68～82.72 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，r=0.999 9;平均回收率為97.5%，RSD為2.8%。結(jié)論 本文方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，可用于益肝靈片的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 益肝靈片;水飛薊賓;高效液相色譜法
益肝靈片為保肝藥，主要成分為水飛薊素，屬于黃酮類化合物，由水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊丁3種同分異構(gòu)體組成[1]�，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用紫外分光光度法，以水飛薊賓計(jì)算益肝靈片中水飛薊素的含量，測(cè)定結(jié)果是水飛薊素(總黃酮)的含量[2]，結(jié)果受顏色變化等因素影響較大，并不能準(zhǔn)確測(cè)定水飛薊賓的含量。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)益肝靈片的質(zhì)量，本文建立了益肝靈片中水飛薊賓含量測(cè)定的高效液相色譜法，并與紫外分光光度法進(jìn)行比較。本文方法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
1 儀器與試藥
DIONEX高效液相色譜儀(戴安公司)，UVD170U型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器,P680A四元梯度泵, Chromeleon化學(xué)工作站;紫外分光光度計(jì)(日立U3210);SK7200H型超聲波清洗器(上�？茖�(dǎo)超聲儀器廠)，工作頻率59 kHz，輸出功率350 W。
水飛薊賓對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，0856-200203)，益肝靈片(廣州白云山制藥總廠，批號(hào)：4050001，4060001，070303，規(guī)格：38.5 mg/片)。甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為高純水。
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液的制備
2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥3 h后的水飛薊賓對(duì)照品約10.34 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液(質(zhì)量濃度為206.8 μg·mL-1)。
2.1.2 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于水飛薊賓10 mg)，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;精密吸取上清液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。
2.1.3 陰性對(duì)照液的制備 根據(jù)處方配制陰性對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)方法處理得陰性對(duì)照液。
2.2 測(cè)定方法 由于水飛薊賓對(duì)照品和供試品中都同時(shí)含有水飛薊賓和異水飛薊賓，因此按外標(biāo)法以水飛薊賓與異水飛薊賓峰面積之和計(jì)算。
2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜柱為Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司);流動(dòng)相：甲醇?1%冰醋酸溶液(體積比49∶51);流速：1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm ;柱溫：30 ℃。分別取對(duì)照品溶液(水飛薊賓質(zhì)量濃度為12 μg·mL-1)、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液20 μL注入色譜儀，理論板數(shù)以水飛薊賓計(jì)算應(yīng)不低于4000;水飛薊賓的拖尾因子為0.94，保留時(shí)間約為25 min，水飛薊賓和異水飛薊賓與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5;陰性樣品不干擾樣品測(cè)定，見(jiàn)圖1。
2.4 方法學(xué)考察
2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取一定量的水飛薊賓對(duì)照品貯備液，加甲醇稀釋成水飛薊賓質(zhì)量濃度為20.68、31.02、41.36、51.70、62.04、82.72 μg·mL-1的溶液。依次進(jìn)樣20 μL，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以峰面積(A)對(duì)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行回歸，得水飛薊賓回歸方程為A =667.95ρ+0.11，r=0.999 9。表明水飛薊賓質(zhì)量濃度在20.68～82.72 μg·mL-1之間與峰面積線性關(guān)系良好。
2.4.2 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為41.36 μg·mL-1的水飛薊賓對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)測(cè)定5次，其峰面積的RSD值為2.0%，表明儀器精密度良好。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)：070303)在0、2、4、6、8、12、24 h 分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)：070303)樣品6份，照“2.1.2”方法處理并測(cè)定，結(jié)果水飛薊賓平均含量為 6.45 μg·mL-1，RSD為1.5%，表明分析方法精密度良好。
2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：070303)共6份，精密加入水飛薊賓對(duì)照品，照“2.1.2”方法處理并測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果水飛薊賓平均回收率為97.5%，RSD為2.8%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，見(jiàn)表1。表1 水飛薊賓回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.5 樣品測(cè)定
取益肝靈片3批，照“2.1.2”方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液(12 μg·mL-1)與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算樣品中水飛薊賓的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。表2 樣品中水飛薊賓測(cè)定結(jié)果
3 討 論
3.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇
取對(duì)照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在288 nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm，見(jiàn)圖2。
3.2 流動(dòng)相的選擇
曾試用甲醇?0.05 moL/L磷酸二氫鉀溶液(0.2 moL/L磷酸調(diào)節(jié)pH值4.0)[3]、甲醇?0.02%冰醋酸溶液[4]和甲醇?1%冰醋酸溶液[5]為流動(dòng)相，并比較不同比例流動(dòng)相對(duì)分離的影響，結(jié)果以甲醇?1%冰醋酸溶液(體積比49∶51)為流動(dòng)相時(shí)的峰形較好，分離度較高。
3.3 提取時(shí)間的考察
考察超聲提取10、15、20、25、30 min對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明，超聲提取20 min含量達(dá)穩(wěn)定，時(shí)間增加，含量不會(huì)增加。因此選擇甲醇為溶劑，超聲提取20 min。
3.4 2種含量測(cè)定方法比較
理論含量根據(jù)原料水飛薊素的含量和理論投料量計(jì)算得出。原料水飛薊素的含量測(cè)定方法包括紫外分光光度法測(cè)定水飛薊素(總黃酮)含量，結(jié)果以水飛薊賓計(jì)算，不得少于68%;以及高效液相色譜法測(cè)定水飛薊賓的含量，結(jié)果含水飛薊賓和異水飛薊賓不得少于30%。2種方法測(cè)定結(jié)果比較可見(jiàn)，紫外分光光度法測(cè)定益肝靈片中水飛薊素以水飛薊賓計(jì)，實(shí)際是測(cè)定總黃酮的量，結(jié)果容易受到各種因素影響而出現(xiàn)偏差，相比之下，采用HPLC法對(duì)益肝靈片中水飛薊賓進(jìn)行含量測(cè)定的結(jié)果更準(zhǔn)確。見(jiàn)表3。表3 2種含量測(cè)定方法結(jié)果比較 批號(hào)紫外分光光度法測(cè)定含量理論含量HPLC法測(cè)定含量理論含量405000138.538.516.517.0406000142.438.517.717.607030337.338.516.816.5
注：理論含量=原料水飛薊中水飛薊賓的含量×理論投料量
【參考文獻(xiàn)】
[1] 周霞，萬(wàn)軍，吳純潔，等.水飛薊素制劑的研究概況[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(1)：112.
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[4] 周鐵文.益肝靈膠囊中水飛薊賓的含量測(cè)定[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2006,12(6)：81.
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