冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究進(jìn)展

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　　【摘要】 冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA-binding protein，CIRP)是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，伴隨紫外線照射、冷應(yīng)激及缺氧等過程而過量表達(dá)。研究證實(shí)，CIRP無(wú)論是在核酸結(jié)構(gòu)上，還是在氨基酸結(jié)構(gòu)上都是高度保守，具有較高的同源性，其細(xì)胞定位和生理功能可能具有組織特異性;CIRP不僅具有介導(dǎo)冷誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，而且可能參與人和動(dòng)物紫外線照射應(yīng)激、缺氧應(yīng)激、腫瘤發(fā)生，以及腫瘤抑制等多種生理病理過程。因此，深入開展CIRP的功能性研究和應(yīng)用性研究具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值和臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

　　【關(guān)鍵詞】 冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白;應(yīng)激反應(yīng);腫瘤

　　低溫對(duì)細(xì)胞的作用包括：降低細(xì)胞的耗氧量和代謝率，調(diào)節(jié)氧化還原和改變基因的表達(dá)[1、2]。低溫冷適應(yīng)的分子機(jī)制，尤其對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，目前了解得很少。對(duì)寒冷的反應(yīng)包括：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期和代謝等過程[3、4]。許多研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞處在亞低溫(32℃)時(shí)，即使只有一瞬間，其內(nèi)部所發(fā)生的變化遠(yuǎn)比我們目前已了解得要多得多。一旦機(jī)體暴露在低溫環(huán)境下，特定的冷休克蛋白立即做出反應(yīng)，確保細(xì)胞或機(jī)體能快速的適應(yīng)環(huán)境。雖然在過去的十幾年里大量的冷休克蛋白被發(fā)現(xiàn)，但是迄今為止僅有兩種被較好的定性：即冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)和RNA結(jié)合基礎(chǔ)蛋白3[5]。本文就CIRP做一個(gè)綜述。

　　1CIRP的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)

　　CIRP最早是在轉(zhuǎn)錄的研究中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紫外線(UV)或與UV相似的藥物損傷DAN時(shí)，CIRP即被誘導(dǎo)產(chǎn)生，且以UV劑量依賴的方式增加[6]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)在亞低溫狀態(tài)下，CIRP亦出現(xiàn)高表達(dá)[6]。Xue等通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，在冷應(yīng)激1~3h后探測(cè)到CIRP，在12h表達(dá)最高，意味著CIRP是在亞低溫環(huán)境中最早的應(yīng)激產(chǎn)物之一。CIRP在成年老鼠的睪丸、肺、心臟、腎、海馬和大腦皮質(zhì)中持續(xù)表達(dá)[7]。在雄性生殖細(xì)胞中CIRP水平根據(jù)不同發(fā)育階段而改變[8]。CIRP位于染色體19p13.3位點(diǎn)上，CIRP蛋白含有172個(gè)氨基酸，兩個(gè)確定的區(qū)域。第一個(gè)是RNA結(jié)合區(qū)域(RMM motif)，它在不同物種及與RNA結(jié)合中高度保守。RRM是被充分鑒定的RNA結(jié)合基序之一，大約由90個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含兩個(gè)高度保守序列(一個(gè)為八聚體，另一個(gè)為六聚體)，分別被定名為核糖核蛋白1(ribonucleoprotein1，RNP1)和核糖核蛋白2(RNP2)，還含有許多其他的保守性氨基酸(多數(shù)為疏水性氨基酸)。第二是富含甘氨酸的區(qū)域(RGG motif)，功能目前尚不明確。

　　2CIRP與應(yīng)激反應(yīng)

　　絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNAs(~90%)是通過帽子依賴(cap-dependent)機(jī)制進(jìn)行翻譯。而這個(gè)翻譯機(jī)制在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)受到抑制，由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES，internal ribosome entry site)(約占細(xì)胞mRNAs的10%)機(jī)制代替帽子依賴機(jī)制進(jìn)行翻譯[9]。研究證實(shí)cirp在亞低溫等應(yīng)激環(huán)境中，其轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)最完整，顯示強(qiáng)大的IRES活性[10]。CIRP常常蓄積在一些應(yīng)急顆粒中(應(yīng)急顆粒是細(xì)胞代謝時(shí)期在翻譯過程中沉默的mRNAs累積的地方)，能調(diào)控和聚合特殊mRNAs進(jìn)入應(yīng)急顆粒[11、12]。CIRP的核質(zhì)分布由它C末端區(qū)域的甲基化來(lái)控制[11]。在低溫、UV照射、缺氧等應(yīng)激條件下CIRP表達(dá)增加，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞漿，和有限的幾種RNA(包括幾個(gè)應(yīng)急誘導(dǎo)分子)相結(jié)合，參與DNA損傷的修復(fù)、轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)和增加蛋白質(zhì)的翻譯[13]，起到細(xì)胞保護(hù)作用[14、15]，被認(rèn)為是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白�？梢酝茰y(cè)在應(yīng)激狀況下，CIRP在細(xì)胞內(nèi)的位置可能對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯起到?jīng)Q定性的作用。在UV應(yīng)激反應(yīng)的模型中，通過直接干預(yù)CIRPmRNAs的3'-UTR，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)CIRP的作用靶點(diǎn)[13]。CIRP特異性地結(jié)合到復(fù)制蛋白A(the replication protein A，RPA2)和硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)mRNAs的3'-UTR上。RPA2和TRX是兩種能增加細(xì)胞或機(jī)體對(duì)應(yīng)激反應(yīng)適應(yīng)性能力的蛋白[16、17]。TRX是一種普遍存在的多功能的蛋白，它通過清除(quenching)氧自由基調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)[18]。而RPA2是腫瘤克隆增生的指標(biāo)，是腫瘤治療的靶點(diǎn)[19]。除了因UV照射后應(yīng)急和低氧而產(chǎn)生的翻譯后修飾如甲基化以外，CIRP也被GSK3β激酶磷酸化而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿，和TRX轉(zhuǎn)錄物結(jié)合并通過與整個(gè)轉(zhuǎn)錄相互作用而增加翻譯[20]。在不同的應(yīng)急狀態(tài)中，影響CIRP磷酸化的激酶應(yīng)需要進(jìn)一步研究，從而能了解這些基因的功能。另外，亞低溫的腦保護(hù)作用已被肯定，CIRP是否扮演了積極的角色呢?這需要進(jìn)一步研究。

　　3CIRP對(duì)腫瘤的作用

　　在美國(guó)或西歐，每4個(gè)人中就有1個(gè)可能患癌癥。從病理和臨床觀點(diǎn)看，致癌過程和下面幾個(gè)系列事情發(fā)生：(1)不能被滅活;(2)轉(zhuǎn)化;(3)侵入;(4)轉(zhuǎn)移。多細(xì)胞器官已經(jīng)形成一些機(jī)制去避免細(xì)胞增殖過程中的無(wú)限的增長(zhǎng)和惡變。機(jī)制之一是復(fù)制的衰竭，即當(dāng)致癌變化出現(xiàn)時(shí)能及時(shí)被阻止[21]。從動(dòng)物組織中直接得到的原始細(xì)胞能在體外移植，在不同的環(huán)境中培養(yǎng)和分化。原始細(xì)胞的主要特征是：在出現(xiàn)復(fù)制衰竭前具有分化成幾種不同細(xì)胞的能力。復(fù)制衰竭的特征：顯示某種表型如巨細(xì)胞形態(tài)、β-牛乳糖的活性，和基因型的變化如PAI-1的過表達(dá)以及細(xì)胞周期抑制蛋白的上調(diào)如p21，p16或p19[22]。因此，細(xì)胞如果想要避免衰竭，就需要發(fā)生內(nèi)在或外在的變化。早期認(rèn)為復(fù)制衰竭是組織培養(yǎng)應(yīng)激的結(jié)果，但是有趣的是在良性病變的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了衰竭的細(xì)胞[23]。實(shí)際上，惡性腫瘤并沒有衰竭細(xì)胞，可能是因?yàn)檫@些細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了突變，而具有致癌的性質(zhì)。運(yùn)用高通量復(fù)合遺傳篩選法，發(fā)現(xiàn)CIRP的過表達(dá)增加了P-ERK 1/2的水平，影響了一些蛋白質(zhì)(和翻譯起始有關(guān)的蛋白質(zhì)，如4EB-P1、S6)的磷酸化，而讓鼠原始細(xì)胞得以避免出現(xiàn)衰竭[24]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CIRP在抑制細(xì)胞凋亡中亦起到重要的作用[25]。在一個(gè)有193例患者的隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，CIRP在幾種人類腫瘤中是高表達(dá)的[24]。而在本院腫瘤隊(duì)列研究中，筆者在細(xì)胞漿中發(fā)現(xiàn)了CIRP;然而，我們不能確定CIRP的位置能否在腫瘤發(fā)生中調(diào)節(jié)它的功能。CIRP在33%的克隆性增生中和45%的乳腺癌患者中過表達(dá)的事實(shí)支持它參與了腫瘤的生長(zhǎng)[5]。除了發(fā)現(xiàn)CIRP能作為新的致癌蛋白之外，在近期的一些研究中也發(fā)現(xiàn)了它的抗癌作用。曾等闡述了CIRP可減少前列腺細(xì)胞(LNCaP and PC-3)的增生，更重要的是，CIRP敲除不僅傷害到細(xì)胞的生存，還增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的化學(xué)敏感性，這都顯示CIRP可能是治療前列腺癌新的藥物[26]。CIRP抑制同時(shí)也損害到其他細(xì)胞系(如HeLa，TERA2)的增生，顯示它也可應(yīng)用于其他癌癥的治療。

　　4CIRP抗衰竭的作用

　　衰竭與抗衰竭的關(guān)鍵調(diào)控通路包括：細(xì)胞周期蛋白pRB和p53，致癌基因的高表達(dá)(如c-myc)，端粒酶的持續(xù)性，表觀遺傳學(xué)調(diào)控，小RNA分子的調(diào)節(jié)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等等[27、28]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞衰竭早已得到證實(shí)，而抗氧化酶在對(duì)抗ROS的作用同時(shí)，還能使原始細(xì)胞避免衰竭并增生。例如，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase enzyme，SOD)抗衰竭的能力在許多不同的細(xì)胞和組織中已經(jīng)被研究。SOD表達(dá)增加能延長(zhǎng)初級(jí)成纖維細(xì)胞的生命[29];相反，SOD敲除誘發(fā)細(xì)胞早期出現(xiàn)衰竭[30]，還有就是TRX的抗衰老的作用，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)TRX表達(dá)的轉(zhuǎn)基因鼠顯示了一個(gè)中等的但有意義的生命的延長(zhǎng)[31]。研究證實(shí)CIRP，除了使特殊的mRNAs和翻譯機(jī)制中必須的蛋白活化外，還可能激活一些mRNAs(能編碼參與清除ROS的蛋白，如抗氧化酶TRX)。Lleonart等[5]提出了CIRP抗衰竭通道模型，并得到如下事實(shí)所支持：(1)CIRP表達(dá)水平下降的細(xì)胞比CIRP表達(dá)正常的細(xì)胞對(duì)UV照射更敏感，眾所周知，UV是主要的ROS誘導(dǎo)物[13];(2)當(dāng)UV照射時(shí)，CIRP被激活并引起TRX的表達(dá)[20];(3)缺氧是產(chǎn)生ROS的一個(gè)機(jī)制，同時(shí)也激活CIRP;(4)CIRP刺激基礎(chǔ)翻譯機(jī)制中成分(如eIF4G，4E-BP1和S6)或與它們相互作用，促進(jìn)翻譯[20、24]。另外，CIRP在缺氧時(shí)的高表達(dá)能增加mRNA和蛋白的水平和參與細(xì)胞增生這個(gè)事實(shí)說明他可能參與了新生血管的形成。這很容易讓人去假設(shè)，CIRP的上調(diào)(在大量的癌癥中可觀察到[24、32])是腫瘤對(duì)缺氧做出的反應(yīng)。下面的事實(shí)支持這個(gè)觀點(diǎn)：(1)缺氧時(shí)該蛋白受到刺激;(2)CIRP高表達(dá)增加VEGF蛋白的水平，VEGF是重要的血管生成刺激蛋白;(3)缺氧誘導(dǎo)的GSK3β激酶使CIRP磷酸化，使CIRP的結(jié)合力增加[25]。此外，CIRP激活的抗氧化酶能使ROS的毒害作用減少的可能性也是一個(gè)很有吸引力的假設(shè)，可以解釋，至少在部分上，CIRP高表達(dá)的細(xì)胞能抵抗UV照射產(chǎn)生的毒副作用[13]。5結(jié)論本文章闡述了這個(gè)事實(shí)，作為可能的致癌蛋白，CIRP在高表達(dá)時(shí)有以下特征：(1)增加蛋白合成的能力;(2)直接或間接參與腫瘤發(fā)生;(3)參與原始細(xì)胞的抗衰竭功能;(4)腫瘤惡化中的高表達(dá)。 CIRP抗衰竭的能力，可能和它保護(hù)細(xì)胞免受ROS蓄積的毒害的作用密切相關(guān)。因此，我們認(rèn)為探索在冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白的活性下詳盡的分子調(diào)節(jié)機(jī)制是非常重要的，因?yàn)樵趲讉�(gè)人體病理特性中，包括腫瘤的發(fā)生，它的功能可能和拓寬生理及生物進(jìn)程密切相關(guān)。

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