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微生物培養(yǎng)技術(shù)初探-農(nóng)業(yè)生物技術(shù)論文
論文摘要：文章簡要介紹了微生物不可培養(yǎng)的原因，總結(jié)了培養(yǎng)技術(shù)中存在的問題，提出如何改良培養(yǎng)微生物的技術(shù)，并闡述了模擬自然環(huán)境條件、強調(diào)微生物相互關(guān)系是提高微生物可培養(yǎng)性的關(guān)鍵。
論文關(guān)鍵詞：微生物;培養(yǎng)技術(shù);環(huán)境條件;生物細(xì)胞
目前自然界中只有極少部分微生物能夠得到培養(yǎng)，嚴(yán)重阻礙了對微生物生命活動規(guī)律的研究和微生物資源的開發(fā)。因此必須改進(jìn)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，采用新型培養(yǎng)技術(shù)，提高微生物可培養(yǎng)性，大量培養(yǎng)自然界中存在的微生物，從而更全面、準(zhǔn)確地了解微生物細(xì)胞的生命規(guī)律、獲悉微生物群落中各種微生物之間的動態(tài)相互作用和相互協(xié)調(diào)的規(guī)律，對環(huán)境微生物工藝進(jìn)行準(zhǔn)確地設(shè)計、精細(xì)地調(diào)控和高效地利用。
一、微生物不可培養(yǎng)的原因
對微生物進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)時，由于生活條件的改變，有些微生物不能適應(yīng)而死亡，另一些則通過產(chǎn)生孢子進(jìn)入休眠狀態(tài)或改變細(xì)胞形態(tài)、進(jìn)入維持一定代謝活性但不生長繁殖的“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”，結(jié)果均表現(xiàn)為微生物的“不可培養(yǎng)性”。
實際上，微生物的不可培養(yǎng)性是由于對微生物生長條件及其規(guī)律性的認(rèn)識嚴(yán)重不足，而采取了偏離微生物生長實際情況的培養(yǎng)條件所造成的，這些偏離具體可以包括以下幾個方面：
(一)實驗室中無法完全模擬自然界的環(huán)境條件
由于目前監(jiān)測技術(shù)和手段的限制，人們對微生物生存環(huán)境和自然條件的了解尚不充分。因此，人們沒有或無法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常將培養(yǎng)條件進(jìn)行簡化：將微生物置于恒溫、恒濕、黑暗等環(huán)境中;將微生物限制在“板結(jié)”的瓊脂或不擾動的液體介質(zhì)中;簡化微生物的營養(yǎng)組成沒有提供微生物生長繁殖所必需的某些化學(xué)物質(zhì)等等。所以在自然界中可以生長繁殖的微生物，在“純培養(yǎng)”中生長條件得不到滿足，從而導(dǎo)致了微生物的不可培養(yǎng)性。
(二)生長緩慢的微生物被忽視
環(huán)境中很多微生物都聚集生長，當(dāng)將這些微生物接種至培養(yǎng)基時，適合生長的微生物由于生長快而占據(jù)優(yōu)勢地位，它們對營養(yǎng)成分的大量攝取使生長緩慢的微生物得不到充足營養(yǎng)而生長受到抑制。
(三)采用高濃度的營養(yǎng)基質(zhì)
最初對微生物的培養(yǎng)是在富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，但是由于自然界中微生物數(shù)量龐大，其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏，多數(shù)處于“岔營養(yǎng)”狀態(tài)。常規(guī)純培養(yǎng)對這種認(rèn)識不允分，通常將寡營養(yǎng)微生物迅速置于富營養(yǎng)狀態(tài)，微生物初期的快速生長會產(chǎn)生大量的、微生物自身難以調(diào)節(jié)的過氧化物、超氧化物和羥基自由基等“毒性氧物質(zhì)”，該類物質(zhì)快速、過量的積累會破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而表現(xiàn)出微生物的不可培養(yǎng)性。
(四)環(huán)境微生物之間的相互關(guān)系被忽略
微生物相互關(guān)系繁多復(fù)雜，包括：(1)種間的偏利共生關(guān)系和互惠共生關(guān)系，兩者的共性是至少一個群體提供另一些群體所需的生長因子而使微生物群體獲利;(2)群體感應(yīng)，這種關(guān)系被認(rèn)為是通過細(xì)菌間的信息交流來調(diào)控細(xì)菌的群體行為：細(xì)胞通過感應(yīng)一種胞外低分子量的信號分子來判斷菌群密度和周圍環(huán)境的變化，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)的細(xì)菌表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為。以上這兩種關(guān)系都是微生物生長所必需的。由于人們目前對環(huán)境中微生物之間多數(shù)復(fù)雜的相互關(guān)系所知甚少，采用的培養(yǎng)技術(shù)沒有將這種關(guān)系考慮在內(nèi)。純培養(yǎng)技術(shù)將待培養(yǎng)的微生物與其它微生物群體、以及生存環(huán)境人為地分離開，種間的共生關(guān)系和信息交流被阻斷，微生物缺乏必需的生長因子和信號分了而死亡，表現(xiàn)出微生物的不可培養(yǎng)性。
(五)對微生物生長狀況進(jìn)行判斷的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)存在的缺陷，也導(dǎo)致某些微生物生長不被發(fā)覺，表現(xiàn)為“不可培養(yǎng)”
例如，生存在貧營養(yǎng)環(huán)境中的微生物盡管能夠在低濃度營養(yǎng)條件下生長，但是有些微生物生長速度極為緩慢，在常規(guī)設(shè)定的培養(yǎng)周期內(nèi)(例如l周)沒有長成肉眼可見的菌落就被遺棄。除此之外，還有一些寡營養(yǎng)微生物不會形成菌落，而是在固體培養(yǎng)基表面遷徙生長和擴散生長，它們形成只能顯微可見的幾個細(xì)胞組成的小型集合。這兩種情況下，改變微生物生長的判斷標(biāo)準(zhǔn)或者檢測方法，就可以改變微生物的“不可培養(yǎng)性”。
總之，導(dǎo)致微生物不可培養(yǎng)的因素有多種，有些是因為目前技術(shù)手段的限制，有些是因為人類認(rèn)識水平的不足。克服這些制約因素，就可以較好地提高微生物的可培養(yǎng)性。目前，提高微生物可培養(yǎng)性的方式可分為兩大類，即改進(jìn)培養(yǎng)措施和開發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)。
二、目前微生物培養(yǎng)技術(shù)存在的問題
目前通過可培養(yǎng)微生物的總體數(shù)量來判斷微生物可培養(yǎng)性，進(jìn)而評價微生物培養(yǎng)方法的優(yōu)劣，然而，這項評價指標(biāo)沒有考慮可培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)。實際上，表征微生物可培養(yǎng)性不僅僅要根據(jù)可培養(yǎng)微生物的總體數(shù)量，還要分析可培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)，即可培養(yǎng)微生物的種類豐富度和均勻度，微生物可培養(yǎng)性指標(biāo)應(yīng)該是這3種因子的函數(shù)，即：C=f(P，R，E)，其中：
C——微生物的可培養(yǎng)性，反映可培養(yǎng)微生物的種類和數(shù)量占實際微生物總種類和數(shù)量的比例;
P——可培養(yǎng)微生物的細(xì)胞數(shù)(CFU/L)，即傳統(tǒng)可培養(yǎng)性的涵義;
R——可培養(yǎng)微生物的種類豐富度，即可培養(yǎng)微生物的種類數(shù)目;
E——可培養(yǎng)微生物的種類均勻度。
E=■=■
其中：H——香農(nóng)-韋納指數(shù);
Pi——種i的個體在可培養(yǎng)微生物全部個體中的數(shù)量比例。
該公式中，各因素的重要性為R>P>E，即可培養(yǎng)微生物的種類豐富度重要性最高。
在目前實行的幾種培養(yǎng)方法中，模擬自然環(huán)境條件，維持微生物種群間的相互關(guān)系是提高環(huán)境中微生物可培養(yǎng)性的關(guān)鍵。因此，微生物培養(yǎng)技術(shù)的研究應(yīng)該主要圍繞在這一方面，進(jìn)行深入改進(jìn)和發(fā)展，例如，可考慮將環(huán)境微生物用環(huán)境介質(zhì)混合培養(yǎng)至生長穩(wěn)定階段，然后將菌液離心過濾，用上清液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，這些方法由于在培養(yǎng)過程中引入了多種微生物自然分泌的信號分子和促進(jìn)復(fù)活因子，均可較好地強化微生物之間的相互關(guān)系，而克服引入單一信號分子的效果有限且操作費時費力的缺點。此外，在培養(yǎng)過程中結(jié)合多種培養(yǎng)因素、組合采取多種培養(yǎng)方案來取代模擬一種培養(yǎng)條件的方案，可以獲得更多可培養(yǎng)的微生物、取得更高效的培養(yǎng)結(jié)果。
三、培養(yǎng)微生物技術(shù)的改良措施
(一)減少毒性物質(zhì)的毒害作用
由于常規(guī)培養(yǎng)方法使用的高濃度營養(yǎng)基質(zhì)不利于微生物生長，適當(dāng)降低營養(yǎng)基質(zhì)的濃度可以減弱這種不利影響，研究發(fā)現(xiàn)低濃度基質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌在數(shù)量和種類上均多于高濃度基質(zhì)的培養(yǎng)基，但營養(yǎng)濃度過低時反而會使培養(yǎng)出的微生物數(shù)量下降。實際上，營養(yǎng)基質(zhì)濃度最好與微生物自然生長環(huán)境相近，例如，輔以少量生長因子的天然海水或土壤浸提液作為培養(yǎng)基可以很好地培養(yǎng)海洋微生物和土壤微生物。另外，多聚物只有被水解為小分子物質(zhì)時才能被微生物利用。以多聚物為碳源，能有效減緩毒性氧釋放的速度，避免微生物在短時間內(nèi)受到高強度的毒性作用。同時，充足的氧氣有時也是毒性氧產(chǎn)生的原因之一，減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓可減弱毒性氧的影響。以上三種措施均可減少微生物代謝過程產(chǎn)生的毒性氧，但有些情況下，毒性氧來源于微生物生命活動以外的過程，例如高壓滅菌。
為了減少各種過程產(chǎn)生的毒性氧，可向培養(yǎng)過程中加入具有毒性氧降解能力的物質(zhì)，例如過氧化氫酶、丙酮酸鈉等過氧化氫降解物和抗氧化劑二硫代二丙酸。已經(jīng)證實這些物質(zhì)可使某些處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌的可培養(yǎng)性得到不同程度的恢復(fù)。其中內(nèi)酮酸鈉對微生物可培養(yǎng)性恢復(fù)的效果最好，只有其有穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點。
(二)維持微生物間的相互作用
在培養(yǎng)基中加入微生物相互作用的信號分子就可簡單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求，例如加入�；兼滈L度各異的氦酰高絲氨酸內(nèi)酯均能有效提高細(xì)菌的可培養(yǎng)性，而與革蘭氏陰性菌多種基因調(diào)控有關(guān)的另一種信號分子cAMP比氮酰高絲氨酸內(nèi)酯能夠促使更多細(xì)菌得到培養(yǎng)。同源性分析結(jié)果表明Rpf存在于多種革蘭氏陽性菌中，推測原核生物可能廣泛存在該類物質(zhì)，因此，可考慮加入同類型的Rpf來提高環(huán)境中微生物可培養(yǎng)性。
(三)其他改進(jìn)措施
1.延長培養(yǎng)時間：對“寡營養(yǎng)菌”的培養(yǎng)，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間，使其能長至肉眼可見的尺度。當(dāng)然培養(yǎng)時間不能無限增長，因為培養(yǎng)時間越長，對培養(yǎng)環(huán)境的無菌要求就越高。
2.供應(yīng)新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過程不同，因此對反應(yīng)的底物要求也不盡相同。供應(yīng)微生物需要的特有底物有助于新陳代謝反應(yīng)的進(jìn)行及微生物的正常生長。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體應(yīng)用到微生物培養(yǎng)中，能夠發(fā)現(xiàn)未知的生理型微生物。
3.利用瓊脂替代物：瓊脂對某些微生物具有毒性作用，采用無害且凝結(jié)作用較好的替代物質(zhì)作為培養(yǎng)基固化劑，可以增加微生物的可培養(yǎng)性。
4.分散微生物細(xì)胞：自然界中很多微生物聚集生長，形成“絮體”和“顆粒”等，致使其內(nèi)部的微生物不易被培養(yǎng)。對“絮體”和“顆粒”進(jìn)行適度的超聲處理，將細(xì)胞分散再進(jìn)行培養(yǎng)，可以使更多的微生物接觸培養(yǎng)基而得到培養(yǎng)。
四、結(jié)語
總之，由于微生物群落及其生存環(huán)境的復(fù)雜性，在任何情況下試圖大量培養(yǎng)微生物都不能僅局限于一種或幾種方法，而應(yīng)綜合采用多種有效的方法。另一方面，還應(yīng)在發(fā)展微生物培養(yǎng)技術(shù)的同時，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，使兩種方法相輔相成，更好地提高微生物的可培養(yǎng)性。
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