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多種屬CpG ODN誘導(dǎo)特異性抗體反應(yīng)的研究論文
目的 探討人工合成的CpG ODN對(duì)不同物種的免疫刺激活性，開(kāi)發(fā)具有廣譜免疫刺激活性的CpG ODN。 方法 將特定的CpG ODN單獨(dú)或與不同的抗原聯(lián)合分別免疫雞和小鼠，用ELISA檢測(cè)不同時(shí)間雞和小鼠特異性抗體的滴度。 結(jié)果 CpG ODN均能誘導(dǎo)雞和小鼠產(chǎn)生抗原特異性抗體，且抗體水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 這種CpG ODN在一定程度上具有廣譜免疫刺激特性。Abstract:Objective To investigate the immune stimulation activity of CpG oligodeoxynucleotides to different species and develop CpG oligodeoxynucleotides that possess broad-spectrum immune stimulation activity. Method Chickens and mice were respectively vaccinated with CpG oligodeoxynucleotides or synergistically with different antigens, and then titers of specific antibody in the blood serums of chickens and mice were detected with ELISA. Results CpG oligodeoxynucleotides could induce the generation of antigen specific antibody in chickens and mice, and the level of antibodies in groups which use CpG ODN as adjuvant is higher than that in the control group (P<0.05). Conclusion CpG ODN that we made restrictively possesses broad-spectrum immune stimulation activity.
Key words:CpG ODN；multi?species specificity；vaccine
包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作為免疫刺激信號(hào)可以被動(dòng)物的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，隨后CpG ODN刺激人類和多種動(dòng)物產(chǎn)生天然的和獲得性的免疫應(yīng)答。CpG ODN主要通過(guò)TLR9活化免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。因此，CpG ODN作為佐劑已廣泛應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤的預(yù)防和治療［1］。但CpG ODN存在種屬特異性問(wèn)題，這一問(wèn)題限制了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論的外推性［2］。所以，尋找和開(kāi)發(fā)具有廣譜識(shí)別特性的CpG ODN具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文主要通過(guò)觀察雞和小鼠血清中特異性抗體的變化來(lái)評(píng)價(jià)CpG ODN對(duì)不同抗原的免疫增強(qiáng)效果，進(jìn)而確定這種CpG ODN是否能夠克服物種限制性這一問(wèn)題。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物健康1日齡小雞，健康50日齡SPF雞，購(gòu)自廣東省農(nóng)科院；2月齡BALB /c小鼠， 雌性， 體質(zhì)量20 g左右，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2003A074。
1.1.2 試劑10 mg/mL豬囊蟲(chóng)抗原、豬囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpG ODN由本實(shí)驗(yàn)室保存［3,4］，SPA?HRP購(gòu)自上海生物制品研究所。
1.2 動(dòng)物分組及免疫方案
1.2.1 雞實(shí)驗(yàn)組取健康1日齡小雞，隨機(jī)分成A、B、C三個(gè)組，每組20只，各組飼養(yǎng)條件相同。7日齡時(shí)各組處理如下：A為對(duì)照組，不作任何處理；B組滴鼻免疫VTS76疫苗（100 μg/kg）；C組滴鼻免疫VTS76疫苗（100 μg/kg），并同時(shí)頸部皮下注射免疫佐劑CpG ODN（100 μg/kg），21日齡時(shí)B、C組按相同的處理加強(qiáng)免疫1次。
1.2.2 BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠60只， 隨機(jī)分為3組， 每組間隔2周免疫2次。采用肌肉注射法， 將質(zhì)粒DNA溶液注射到小鼠兩側(cè)股四頭肌。A組注射VR1020 100 μg/kg作為陰性對(duì)照; B組注射VTS76 （100 μg/kg）; C組注射VTS76和CpG ODN各100 μg/kg。
1.3 抗原特異性抗體檢測(cè) 96孔培養(yǎng)板用碳酸氫鈉緩沖液(15 mmol/L Na2CO3, 35 mmol/L NaHCO3, PH 9.6)適當(dāng)稀釋的豬囊蟲(chóng)抗原包被，4 ℃過(guò)夜孵育。用含Tween?20的PBS(0.1 mol/L PBS，0.1% Tween?20)洗滌3次，每次3 min；每孔加入100 mL經(jīng)PBS(0.1 mol/L PBS，1% BSA)適當(dāng)稀釋的待測(cè)血清，37 ℃孵育2 h。PBS洗滌5次，每孔加入100 mL、1∶40稀釋的SPA?HRP，37 °C孵育2 h。PBS洗滌5次，每孔加入100 mL TMB底物（含0.1 mg/mL 3’3’5’5’?四甲基聯(lián)苯胺的磷酸鹽?檸檬酸緩沖液，pH5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL），37 ℃孵育1 h。每孔加入50 mL H2SO4(0.2 mol/L)終止顯色反應(yīng)。Bio?Rad 3550測(cè)定A450讀數(shù)。待測(cè)樣品A值大于陰性對(duì)照平均A值的3倍為陽(yáng)性。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較均采用方差分析，P<0.05為差異有顯著性。
2 結(jié)果
2.1 CpG ODN對(duì)雞血清中豬囊尾蚴特異性抗體滴度的影響 C組在初次免疫1周后可以檢測(cè)到特異性抗體，但抗體滴度很低；在初次免疫2周和二次免疫1周后，B組和C組特異性抗體滴度明顯上升，且C組顯著高于B組(P<0.05)；二次免疫后2周，B組還有明顯上升，而C組已進(jìn)入平臺(tái)期，維持在一個(gè)較高的水平，兩組之間差異無(wú)顯著性 (P>0.05)。對(duì)照A組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到特異性抗體。以上結(jié)果表明，CpG ODN能夠顯著增強(qiáng)VTS76疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平。見(jiàn)圖1。
圖1 免疫雞特異性抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化（略）
Fig.1 Dynamic changes of titers of specific antibody against of immunized chickens
2.2 CpG ODN對(duì)小鼠血清中豬囊尾蚴特異性抗體滴度的影響 B組和C組在初次免疫1周后可以檢測(cè)到特異性抗體，但抗體滴度很低(1∶20)。二次免疫后1周，B組和C組免疫小鼠的抗體滴度均明顯上升，但差異無(wú)顯著性 (P>0.05)。二次免疫后的第2周到第3周，C組的特異性抗體滴度明顯高于B組(P<0.05)。對(duì)照A組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到特異性抗體。 結(jié)果表明，CpG ODN能夠顯著提高豬囊尾蚴DNA疫苗的體液免疫應(yīng)答水平。見(jiàn)圖2。
圖2 免疫小鼠特異性抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化（略）
Fig.2 Dynamic changes of titers of specific antibody of immunized mice
3 討論
CpG ODN的種屬特異性是指特定序列的CpG ODN僅對(duì)特定種屬的免疫細(xì)胞具有免疫刺激活性。早期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)人類TLR9產(chǎn)生最佳刺激效果的CpG基序是GTCGTT，而對(duì)小鼠TLR9最佳的CpG基序是GACGTT。將對(duì)人免疫細(xì)胞具有強(qiáng)刺激活性的ODN作用于鼠的免疫細(xì)胞時(shí)，僅顯示出很弱的免疫活性，甚至無(wú)免疫活性，反之亦然
�。�5］CpG ODN的種屬特異性與TLR9的有效識(shí)別有關(guān)，即特定種群的TLR9僅識(shí)別特異的CpG ODN序列。研究還發(fā)現(xiàn)，TLR9單個(gè)氨基酸的改變都會(huì)影響CpG ODN的免疫刺激效果
�。�6］目前，對(duì)于TLR9對(duì)ODN的識(shí)別方面有了更深入的認(rèn)識(shí)。由于天然的磷酸二酯(PD)修飾ODN易于降解，所以目前應(yīng)用較多的CpG ODN均為磷硫酰（PS）修飾的ODN。而Tara LR
�。�7］認(rèn)為T(mén)LR9識(shí)別CpG基序的物種特異性僅限定于磷硫酰（PS）修飾的ODN，而天然的磷酸二酯骨架卻不受影響。因此，人類和小鼠的細(xì)胞并沒(méi)有進(jìn)化到可以識(shí)別天然DNA中不同的CpG基序。我們采用的CpG ODN是將60 bp磷酸二酯（PD）修飾的ODN與pUC18載體體外連接，構(gòu)建為重組質(zhì)粒pUC18?ODNs。這種磷酸二酯（PD）修飾的ODN可能更真實(shí)地模擬天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN，克服TLR9識(shí)別CpG基序的物種特異性，從而提高自身對(duì)多種屬的免疫刺激活性。
Kandimalla ER［8］設(shè)計(jì)了一種具有潛在的免疫刺激活性并能克服物種特異性識(shí)別效應(yīng)的二核苷酸基序RpG。包含GARGTT和GTRGTT基序的ODN能夠活化J774細(xì)胞的NF?κB通路，同時(shí)誘導(dǎo)小鼠和人類細(xì)胞分泌大致相等水平的細(xì)胞因子。與CpG ODN相比，RpG ODN能夠同時(shí)被HEK293細(xì)胞中的小鼠TLR9所識(shí)別。該種RpG ODN還能誘導(dǎo)其它多個(gè)物種的外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖。此研究揭示了我們可以通過(guò)對(duì)寡核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾繞過(guò)TLR9識(shí)別的物種限制性，達(dá)到誘導(dǎo)多種屬產(chǎn)生免疫應(yīng)答的目的。
本研究結(jié)果表明，本研究所制備的CpG ODN能夠同時(shí)提高雞和小鼠的體液免疫應(yīng)答水平，這一研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)具有廣譜免疫識(shí)別特性的CpG ODN提供了重要的線索。當(dāng)然，目前的研究還有待進(jìn)一步深入，包括擴(kuò)大物種的實(shí)驗(yàn)范圍（特別是哺乳動(dòng)物），同時(shí)研究體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。
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